Après avoir débuté au cinéma comme accessoiriste et cantinier, il joue le rôle de Paul Dedalus dans Comment je me suis disputé… (ma vie sexuelle) d’Arnaud Desplechin qui lance sa carrière, et pour lequel il reçoit le César du meilleur espoir masculin en 1997. Il s'impose alors à la fin des années 1990 comme un des acteurs les plus en vue du cinéma d'auteur. Il reçoit en 2005, le César du meilleur acteur pour Rois et Reine, un film de son metteur en scène fétiche Arnaud Desplechin. Réalisateur de cinéma, Mathieu Amalric est également l’auteur d'un film autobiographique Mange ta soupe en 1997, puis surtout du Stade de Wimbledon (2001) pour lequel il offre un rôle marquant à Jeanne Balibar. En 2003 il présente La Chose publique à la Quinzaine des réalisateurs du Festival de Cannes. Deux ans plus tard, il tourne un rôle secondaire sous la direction de Steven Spielberg dans le film Munich. En 2008, il obtient le second César du meilleur acteur de sa carrière pour son rôle de journaliste atteint du locked-in syndrome dans Le Scaphandre et le Papillon de Julian Schnabel. Il intervient également à la Fémis en tant qu'enseignant. En 2010, il gagne le Prix de la mise en scène à Cannes pour Tournée, son quatrième long métrage en tant que réalisateur.